Science：揭秘胰腺癌隐形外衣下的“神秘靶点”，免疫治疗迎来新曙光！

什么是“神秘抗原”（Cryptic Antigens）？基因组的隐秘角落

生命活动的核心秘密藏在基因组（Genome）中，基因组中的DNA序列指导细胞合成RNA，再由RNA指导合成蛋白质。这些蛋白质负责细胞的各种功能。为了让T细胞识别出异常细胞（比如癌细胞），细胞会将一部分蛋白质降解成小片段——肽段（Peptides），然后将这些肽段呈递到细胞表面的一种分子上，叫做人类白细胞抗原I类（Human Leukocyte Antigen Class I, HLA-I）。T细胞就像巡逻兵，通过检查HLA-I上呈递的肽段来区分“自己”和“非己”，一旦发现异常肽段（比如病毒肽段或肿瘤特异性肽段），就会发起攻击。

传统上，我们认为只有基因组中明确标注为“开放阅读框”（Open Reading Frame, ORF）的区域才会翻译产生蛋白质。这些ORF通常编码我们熟知的各种功能蛋白。然而，庞大的人类基因组中只有很小一部分是ORF。其余的区域，包括长非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）、基因的5'端和3'端的非翻译区域（5' and 3' Untranslated Regions, UTRs），以及基因内部的内含子（intORFs），曾被认为是“非编码”区域。

但科学研究发现，在特定条件下，尤其是癌症细胞中，这些非编码区域或者ORF中非典型起始位点、移码（Frameshift）等异常机制下产生的序列，也可能被翻译成肽段。这些肽段就叫做“非经典肽段”（noncanonical peptides）或“神秘抗原”（Cryptic Antigens）。它们是基因组“暗物质”的产物，就像隐藏在基因组地图边缘、未被正式标记的小径。理论上，如果这些神秘抗原只在癌细胞中产生，不在正常细胞中出现，它们就可以成为非常理想的T细胞靶点。然而，在实体瘤中，这些神秘抗原的特征及其作为T细胞靶点的潜力在很大程度上仍是未解之谜。

拨开迷雾：利用类器官（Organoids）聚焦癌症细胞

要找到并研究肿瘤细胞表面的神秘抗原，首先需要获得足够多的纯净肿瘤细胞样本。对于胰腺癌来说，这是一个巨大的挑战。研究发现，胰腺癌肿瘤（无论是原发灶还是转移灶）的一个典型特点是肿瘤细胞比例低（在分析的PDAC患者队列中，肿瘤细胞纯度中位数约为20-30%，远低于其他一些实体瘤类型），肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中充满了大量的基质细胞（Stromal cells）和免疫细胞。

传统的肿瘤样本分析，即使是切除的肿瘤组织，也会包含大量这些非肿瘤细胞。这些非肿瘤细胞也会呈递肽段，这就像在嘈杂的环境中试图听清一个特定人的声音，会受到严重的干扰，使得难以确定哪些肽段是真正来自肿瘤细胞的。

为了解决这个问题，研究团队采用了一种巧妙的方法：利用患者来源的类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）。PDOs是将患者的肿瘤组织在体外模拟其原始微环境进行三维培养形成的微型“肿瘤”。这种方法可以在体外大量扩增肿瘤细胞，同时极大地减少甚至清除肿瘤微环境中的基质细胞和免疫细胞成分。

研究人员对12个PDAC患者的PDOs进行了全面的多组学分析，包括全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）、RNA测序（RNA Sequencing, RNA-seq）和免疫肽谱分析（Immunopeptidomics）。他们通过RNA-seq数据对PDOs的基质和免疫细胞基因表达谱进行了评估。结果发现，与匹配的患者实体瘤样本相比，PDOs中的基质基因程序和免疫基因程序的表达显著降低（类器官样本的基质得分和免疫得分远低于匹配的实体瘤样本，且通过单细胞RNA-seq分析，类器官来源的肽段源基因模块得分在恶性细胞群中富集）。这有力地证明了PDOs成功地富集了恶性肿瘤细胞，为后续高分辨率地表征肿瘤细胞呈递的肽段奠定了基础。

大海捞针：在胰腺癌免疫肽谱中发现海量神秘抗原

有了富集了肿瘤细胞的PDO样本，研究人员就可以利用高深度免疫肽谱技术，以前所未有的精度去“扫描”胰腺癌细胞表面HLA-I呈递的所有肽段。简单来说，他们使用特异性的抗体将HLA-I分子及其呈递的肽段从PDOs中拉下来，然后用质谱仪（Mass Spectrometry, MS）鉴定出这些肽段的序列。

他们对11个HLA-I表达正常的PDAC PDOs进行了免疫肽谱分析（PDOs具有完整的HLA-I表面表达和对IFN-γ的响应性）。总共鉴定到了超过91,000个不同的PDAC HLA-I呈递肽段（每个PDO样本鉴定到的独特HLAp数量在8000到18500之间），绝大多数肽段长度为8-11个氨基酸，符合HLA-I结合肽段的典型特征（肽段长度分布主要集中在9和10个氨基酸）。

首先，研究人员尝试寻找传统的靶点——突变来源的新抗原（mutHLAp）。他们将患者特定的基因突变信息整合到质谱检索数据库中。尽管PDOs相比实体瘤提高了突变检测的灵敏度，但他们发现，通过免疫肽谱实际检测到的内源性表达的mutHLAp数量非常少（11个分析的PDO样本中，7个未检测到mutHLAp，总共只在4个样本中检测到5个mutHLAp）。这再次强调了在胰腺癌中寻找其他类型抗原的重要性。

接下来，研究人员将注意力转向了“神秘抗原”。他们构建了一个包含翻译自新型、未注释的ORF（novel unannotated ORFs, nuORFs）序列的定制化蛋白质数据库，并对免疫肽谱数据进行检索。结果令人振奋：他们在11个PDO系中鉴定到了1722个（1712个独特）神秘抗原（ncHLAp）（总共检测到1722个，分布在各个PDO中），平均每个PDO有数百个（中位数257个）。这些ncHLAp在总的免疫肽谱中的比例相当可观（ncHLAp占比中位数为5.1%，范围2.2%到10.1%）。

这些神秘抗原的来源非常多样，包括内含子ORF（intORFs）、长非编码RNA（lncRNAs）、5'和3'非翻译区域（UTRs）中的ORF，以及其他另类阅读框。研究人员还对3个实体瘤样本进行了免疫肽谱分析，同样检测到了数量可观的ncHLAp（总共493个独特ncHLAp，占比3.8%），且其肽段长度分布和来源biotype与PDOs高度相似，证实这些神秘抗原不仅存在于体外培养的PDOs中，也真实存在于患者体内的肿瘤组织中（in situ），并非体外培养的产物。这就像不仅在实验室里发现了这些“隐形标记”，还在敌人的实际战衣上找到了它们的踪迹。

火眼金睛：筛选出“癌症限制性”神秘抗原

发现神秘抗原只是第一步，关键在于它们是否具有“癌症限制性”（Cancer Restriction），也就是说，它们是否主要或只在癌细胞中表达和呈递，而在正常健康组织中不存在。如果神秘抗原在正常组织中普遍存在，T细胞识别它们可能会导致自身免疫反应，造成严重的副作用。

为了严格评估神秘抗原的癌症限制性，研究团队建立了一个“翻译中心性”的筛选流程。他们不仅仅看这些nuORFs的序列是否存在于正常基因组中（这是肯定的，它们是基因组的一部分），而是去检查这些nuORFs在正常健康组织中是否有被“翻译”的证据。他们利用了大量公开的健康组织数据，包括来自28种不同健康组织的229份免疫肽谱样本、来自8种健康组织的49份核糖体分析（Ribo-seq）样本（Ribo-seq可以检测哪些RNA正在被核糖体翻译），以及来自5份健康胸腺的免疫肽谱样本。

筛选规则非常严格：如果一个神秘抗原的“父本”nuORF在任何一个已分析的健康组织样本中表现出翻译（通过Ribo-seq证据）或HLA-I呈递（通过免疫肽谱证据）的迹象，无论证据多么微弱，这个神秘抗原就会被排除，不被认为是“癌症限制性”的。

这种严格的筛选排除了大部分在正常组织中也有翻译或呈递证据的ncHLAp。相比之下，几乎所有的经典肽段（来自已知蛋白质ORF的肽段）都在至少一个健康组织中显示出翻译证据（99.5%的经典HLAp在健康组织中有翻译证据），这符合已知蛋白质广泛表达的预期，也说明研究团队用于检测正常组织翻译的数据库和方法已经接近饱和，能够有效地筛选出正常组织中真正不翻译的nuORFs。

经过这一轮“火眼金睛”般的严格筛选，最初发现的1712个独特的神秘抗原中，最终保留了517个“癌症限制性”神秘抗原（CR ncHLAp）（经过健康组织IP/MS和Ribo-seq筛选后，剩余536个，再通过胸腺IP/MS筛选，剩余517个），占总数的30.2%。这意味着，这些神秘抗原在已分析的大量健康组织中，都没有检测到翻译或HLA-I呈递的证据。

值得注意的是，胸腺是T细胞学习区分“自己”和“非己”的地方。如果在胸腺中存在某个抗原的翻译或呈递，T细胞会对这个抗原产生耐受，未来就不会攻击它。令人欣喜的是，这517个CR ncHLAp中，超过96%（这517个CR ncHLAp的父本nuORFs在胸腺中未检测到翻译证据）来源于在胸腺中未检测到翻译证据的nuORFs，这降低了它们诱导自身免疫反应的风险。

此外，研究还发现，这些CR ncHLAp中有相当一部分是可以在不同患者之间共享的（29%的CR ncHLAp被至少2个患者共享）。特别是针对HLA-A02:01这个最常见的HLA亚型，在7个HLA-A02:01阳性患者中，有48%的HLA-A02:01限制性CR ncHLAp是共享的，其中21%甚至被超过一半的A02:01阳性患者共享。这种共享性对于开发通用型或更广泛适用的免疫疗法至关重要，因为这意味着同一类疗法可能适用于更广泛的患者群体。

招兵买马：“神秘抗原”能激活T细胞吗？

找到了只在癌症中出现（至少在已检测的健康组织中没有）的“神秘标记”，下一个关键问题是：T细胞能否识别这些标记，并被激活？换句话说，这些CR ncHLAp是否具有免疫原性（Immunogenic Potential）？

为了直接评估CR ncHLAp的免疫原性，研究团队建立了一个高度灵敏的离体（ex vivo）T细胞诱导和扩增平台。他们从健康捐献者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中分离出单核细胞，将其诱导分化为树突状细胞（Dendritic Cells, DCs），然后将合成的CR ncHLAp肽段加载到这些DCs上。肽段加载的DCs再用于刺激并扩增捐献者的CD8+ T细胞。这个平台可以在体外模拟T细胞识别抗原并活化的过程。

研究人员测试了56个ncHLAp肽段（其中33个是CR ncHLAp，23个是非CR ncHLAp），总共评估了超过1100种不同的T细胞系与肽段的组合。通过检测T细胞对肽段刺激的反应，比如释放细胞因子（如IFN-γ）或上调表面激活标志物（如CD137），来判断肽段是否具有免疫原性。

结果显示，很大一部分CR ncHLAp确实具有免疫原性（在测试的33个CR ncHLAp中，有12个（36.3%）能够诱导产生抗原特异性T细胞）。而作为对照的非CR ncHLAp的免疫原性比例则显著较低（8.7%）。这表明，经过严格筛选的癌症限制性神秘抗原能够有效地激活T细胞。

更重要的是，CR ncHLAp的免疫原性比例（36.3%）与该平台评估的突变来源新抗原的免疫原性比例相当（在测试的26个预测的突变来源新抗原中，10个（38.5%）具有免疫原性）。这说明，神秘抗原作为T细胞靶点的潜力，与传统的突变新抗原一样有希望。

研究人员进一步利用了一种叫做BEAM-T的单细胞技术，在单细胞分辨率下将激活的T细胞与其识别的神秘抗原肽段关联起来，从而分离和鉴定了能够识别CR ncHLAp的T细胞受体（T Cell Receptors, TCRs）。他们重建了17个候选TCR，并对其中一部分进行了详细的功能表征。通过CRISPR技术敲除健康T细胞内源的TCR，然后导入鉴定到的神秘抗原特异性TCR，构建了TCR基因重定向的T细胞（TCR-T）。

他们测试了这些TCR-T细胞对呈递肽段的靶细胞的杀伤能力，以此来评估TCR的功能性亲和力（Functional Avidity）。结果发现，针对不同CR ncHLAp的TCR具有不同的亲和力。其中，针对NU11肽段的TCR001和TCR012显示出极高的功能性亲和力（EC50值非常低，分别为3.7 pg/ml和4.3 pg/ml），而针对NU57肽段的TCR005显示出中等亲和力（EC50 1.2 × 10³ pg/ml）。这表明，可以找到高亲和力地识别神秘抗原的TCRs，这是TCR-T疗法有效性的重要基础。

T细胞出击：靶向神秘抗原的疗法潜力

最终，研究人员需要回答最关键的问题：这些针对CR ncHLAp的高亲和力TCR-T细胞，能否真正识别并杀伤呈现内源性神秘抗原的胰腺癌细胞？以及它们是否能在体内控制肿瘤生长？

首先，他们在离体条件下进行了TCR-T细胞对胰腺癌类器官的杀伤实验。他们使用了能够内源性表达CR ncHLAp（如NU11和NU57）的PDAC类器官（通过改造表达荧光素酶，可以定量评估细胞存活）。然后将之前构建的高亲和力神秘抗原特异性TCR-T细胞与这些类器官进行共培养。

结果显示，高亲和力的TCR001、TCR012（靶向NU11）和TCR005（靶向NU57）TCR-T细胞能够显著识别并激活，表现为分泌大量IFN-γ等细胞因子（与无肽段刺激的类器官共培养相比，TCR001、TCR012、TCR005 TCR-T细胞诱导了高水平的IFN-γ分泌）和T细胞表面激活标志物CD137的上调（这些TCR-T细胞与类器官共培养后，CD137+的CD8+ T细胞比例显著增加）。而且，这种识别是抗原特异性的，与表达无关TCR的T细胞共培养或与HLA-I不匹配的类器官共培养则没有这种反应。

更令人振奋的是，这些高亲和力TCR-T细胞能够有效杀伤胰腺癌类器官（TCR001、TCR012和TCR005 TCR-T细胞能够显著降低类器官的存活率），即使在较低的效应细胞与靶细胞比例下也能实现。通过加入HLA-I阻断抗体，可以抑制这种杀伤作用，进一步证实了杀伤是通过HLA-I呈递的神秘抗原介导的。

最后，研究团队将最有潜力的TCR001 TCR-T细胞带入体内，在免疫缺陷小鼠模型中评估其抗肿瘤效果。他们将PDAC类器官皮下移植到小鼠体内形成肿瘤，然后向小鼠注射TCR001 TCR-T细胞或无关TCR-T细胞作为对照。

结果显示，单次注射TCR001 TCR-T细胞就能够显著延缓胰腺癌肿瘤的生长（相比无关TCR组，TCR001组小鼠的肿瘤体积显著更小）。虽然肿瘤最终仍然会进展，但这在肿瘤免疫治疗的动物模型中已经是非常有力的概念性验证（Proof-of-concept）。研究人员通过在不同类型的免疫缺陷小鼠中重复实验，进一步增强了结论的可靠性。

开启胰腺癌免疫治疗新篇章

这项研究通过高分辨率的免疫肽谱技术和灵敏的离体T细胞平台，填补了癌症抗原研究领域的两大空白：非经典肽段（神秘抗原）的癌症限制性和免疫原性。

研究团队首先通过患者来源的类器官，成功绕开了胰腺癌肿瘤纯度低的问题，首次对胰腺癌的免疫肽谱进行了深入表征。他们不仅发现了突变新抗原数量稀少的事实，更意外地揭示了神秘抗原在胰腺癌中的大量存在（数千个）。

更重要的是，他们建立了一套严格的、基于健康组织翻译证据的筛选流程，成功鉴定出了517个在已分析的健康组织（包括胸腺）中没有翻译和呈递证据的“癌症限制性”神秘抗原（CR ncHLAp）。这些CR ncHLAp中还有一部分可以在患者间共享，具有作为通用型靶点的潜力。

通过离体T细胞平台，研究人员首次证明了这些癌症限制性神秘抗原具有强大的免疫原性，能够有效激活T细胞，其潜力不亚于传统的突变新抗原。他们还分离并构建了针对特定CR ncHLAp的高亲和力TCRs。

最后，体外实验表明，靶向这些神秘抗原的TCR-T细胞能够有效识别和杀伤内源性表达相应神秘抗原的胰腺癌类器官。体内实验也初步证明，TCR-T细胞能够延缓肿瘤生长。

这些发现共同描绘了一幅激动人心的图景：胰腺癌细胞并非没有“身份标记”，基因组中隐藏的神秘角落能够产生独特的癌症限制性肽段，这些“神秘抗原”能够被免疫系统识别，并且有望通过T细胞疗法进行靶向。

这项研究不仅为胰腺癌这一难治性癌症提供了全新的治疗靶点方向，也对癌症生物学、肿瘤免疫学以及T细胞识别“非己”的规则提供了重要的见解。未来，还需要进一步的工作来验证这些CR ncHLAp在更多患者中的普遍性，优化靶向这些抗原的治疗策略（比如TCR-T细胞疗法的设计和递送），并最终将其推向临床评估。这项研究为扩大免疫治疗的受益人群，尤其是那些传统免疫疗法效果不佳的实体瘤患者，开辟了新的道路。寻找并靶向这些隐藏的“神秘武器”，也许正是击败顽固胰腺癌的关键一步。